操作步骤：

大肠杆菌培养
 1.取50μL新鲜的菌液接种到15-50 mL (勿超过 50 mL)的LB培养基（含适量抗生素），37℃震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。 

* 不建议过度培养 (>16 小时) ，因为大肠杆菌会降解而且质粒的产量会降低。
* 不要直接转接甘油冻存的菌。
* 对于在LB培养基中培养的大肠杆菌上述操作步骤是最佳的，当使用 TB or 2xYT 培养基时，一定要确保细菌的密度OD600不要超过3.0。如果菌液过多，按比例相应的增加 Buffers。

无内毒素质粒DNA中提纯化
2. 加入2.5 mL Buffer B1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
注：不完全悬浮易导致菌体裂解不完全，从而使产量降低。

3. 加入 2.5 mL Buffer B2, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
注：切勿剧烈振荡。静置时间不应超过5分钟，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到破坏。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。

4. 加入3 mL Buffer B3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。

5.将离心管转至高速离心机，在室温下14,000 x g 离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）小心吸取离心后的上清液至15 mL管中（避免吸起沉淀）。注：低温下RNase不工作，易有RNA污染。如果离心机转子较冷，将离心管在室温下温育10分钟后再离心。

6.立即转移6 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下5,000 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。
注：如果15 mL的收集管与离心机转子不符，可在台式离心机 3,000 rpm 离心1分钟。

7. 向离心柱中加入5 mL Buffer KS，室温下5,000 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。

8.向离心柱中加入5 mL 70% 乙醇，室温下5,000 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。

9. 将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000 x g开盖离心10分钟，以彻底去除残留的乙醇。
注：此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇，乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。

10. 将离心柱转至一个新的15 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入1 mL的Buffer ES, 室温放置1分钟，5,000 x g 离心5分钟，以洗脱质粒DNA。将15 mL离心管中的洗脱液上柱再放置洗脱1分钟，5,000 x g 离心5分钟。 两次洗脱将提高得率。
 

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