【操作步骤】

1. 病料处理

   取适量病料关节液、心包积液、肺脏等组织，于灭菌研钵充分研磨，用PBS液按照1：3稀释成均匀乳剂，-20℃反复冻融3次以上。

2 . DNA的抽提

(1) 取已冻融好的病料8000r/min离心5min，取上清500μl（或质控样品T，500μl），加50μl SR-I和6μl SR-II，50℃水浴1-2h，并不时颠倒混匀一下。

(2) 加入等量酚：氯仿（1：1），漩涡振荡20s，4℃、12000r/min，离心5min。

(3) 取上清，加入等量氯仿，振荡混匀，4℃、12000r/min，离心5min。

(5) 取400μl上清，加入800μl 无水乙醇，再加40μl SR-III，混匀。-20℃放置30~60min，4℃，12000r/min，离心10min，小心弃上清，沉淀即为DNA。用75%乙醇（灭菌双蒸水配，每次加入500μl）冲洗2次，小心吸去75%乙醇，勿使DNA丢失，室温晾干或超净工作台风干15-25min，加入20μl TU-5溶解即为模板，即用或-20℃保存备用。

3.PCR操作

加样体系：(将下列试剂加入0.5mlPCR反应管中，最好在冰浴条件下加样。)

反应条件：

4.电泳

   称量0.25g琼脂糖，放入锥形瓶，加入25mL 1×TAE液（可配置50×浓缩液，储存备用），于微波炉中熔解，加入1.5μl的TU-9混匀。封闭好电泳槽，加入梳子，倒入琼脂凝胶，待凝固后，将PCR产物6μl混合1.5μl TU-7，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加入3μlTU-8，在100v 电压下，1×TAE液中电泳30分钟，在紫外成像仪下观察结果。

【结果判定】

    在342bp（猪放线杆菌胸膜肺炎）及841bp（副猪嗜血杆菌）位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。

                                     1.DL2000 Marker（TU-9）      

                                     2.标准阳性片段

[注意事项]

1. 每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。

2. 本试剂盒为20头份量试剂，操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况，不予负责。

3. 所有试剂在要求温度下保存，-20℃保存试剂尽量减少反复冻融，使用后的试剂立即放回，避免在室温搁置太久。

4. 尽量建立PCR试验操作区，避免交叉污染。

5. 加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。

6. 吸头、离心管和PCR管在使用前，要高压灭菌，操作过程尽量不要用手接触到管内壁，可用镊子夹取。

7. 注意防止试剂污染，在有效期限前用完。

8. TU-9所装试剂为致癌物质，避免接触到皮肤。如若不甚接触，请立即用洗涤剂清洗。

[有效期]

本制品有效期为1年